Real time PCR quantification of viable Mycobacterium tuberculosis from sputum samples treated with propidium monoazide.
Thiago Milech de Assunção, Eraldo L Batista, Candida Deves, Anne Drumond Villela, Vany Elisa Pagnussatti, Ana Christina de Oliveira Dias, Afrânio Kritski, Valnês Rodrigues-Junior, Luiz Augusto Basso, Diógenes Santiago Santos
Author Information
Thiago Milech de Assunção: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS, Avenida Ipiranga, 6681, TecnoPUC 92A, 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil; Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil.
Eraldo L Batista: Faculdade de Odontologia, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil.
Candida Deves: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS, Avenida Ipiranga, 6681, TecnoPUC 92A, 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil; Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil.
Anne Drumond Villela: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS, Avenida Ipiranga, 6681, TecnoPUC 92A, 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil; Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil.
Vany Elisa Pagnussatti: Faculdade de Farmácia, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil; Hospital São Lucas, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil.
Ana Christina de Oliveira Dias: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS, Avenida Ipiranga, 6681, TecnoPUC 92A, 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil.
Afrânio Kritski: Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
Valnês Rodrigues-Junior: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS, Avenida Ipiranga, 6681, TecnoPUC 92A, 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil; Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil. Electronic address: valnes.rodrigues@acad.pucrs.br.
Luiz Augusto Basso: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS, Avenida Ipiranga, 6681, TecnoPUC 92A, 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil; Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil; Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil.
Diógenes Santiago Santos: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS, Avenida Ipiranga, 6681, TecnoPUC 92A, 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil; Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, PUCRS, Porto Alegre, RS, Brazil. Electronic address: diogenes@pucrs.br.
Diagnostic methods of TB, nowadays, are prone to delay in diagnosis, increased false negative results and are not sensitive to many forms of paucibacillary disease. The aims of this study were to implement a quantitative nucleic acid-based diagnostic test for paucibacillary tuberculosis, enabling the identification and quantification of viable Mycobacterium tuberculosis bacilli by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). The intergenic region of the single-copy inhA-mabA gene was chosen as the target region for design of primers and probes conjugated with fluorophores. The construction of synthetic DNA flanking the target region served as standards for absolute quantification of nucleic acids. Using the intercaling dye, propidium monoazide, we were able to discriminate between viable and dead cells of M. tuberculosis. The diagnosis method showed a broad sensitivity (96.1%) when only compared to samples of smear-positive sputum and ROC analyses shows that our approach performed well and yielded a specificity of 84.6% and a sensitivity of 84.6% when compared to M. tuberculosis colony-forming units counting.
