Gene Expression Nebulas（GEN）是一个多物种基因表达数据门户，收录了通过 RNA 测序数据分析获得的不同条件下的基因表达谱。GEN 旨在为致力于功能基因组学研究的广大科研人员提供便利。作为初步建设阶段，GEN 通过基于本体的系统整合，对来自国家基因组科学数据中心（NGDC）、美国国家生物技术信息中心（NCBI）、欧洲生物信息学研究所（EBI）和 10x Genomics 的 RNA 测序数据进行整理，以展示多个物种全面的转录组和转录后调控图谱。GEN 提供用户友好的界面，并通过浏览、搜索、分析、可视化和下载等功能，支持用户访问、展示和进一步挖掘经过整理的基因表达数据。
从 GSA、SRA、ENA 和 10x Genomics 等数据资源中获取 bulk RNA-seq、单细胞 RNA-seq 及空间转录组数据集的原始测序数据。候选数据集的初步列表按照以下条件进行筛选：
（1）数据为开放获取。
（2）“LibraryStrategy”为“RNA-Seq”，或数据集由 GEN 支持的空间转录组技术产生。
（3）“Sequencing Platform”为“ILLUMINA”。
（4）根据生物学背景对数据集进行分类，包括“Baseline”“Genetic”“Phenotype”“Environment”“Spatial”和“Temporal”。
最终纳入 GEN 的数据集是在此基础上经进一步人工审核整理得到的。
转录组数据处理流程包括原始数据预处理（质量控制）、序列比对和基因表达定量；对于单细胞 RNA-seq 数据，还包括细胞条形码和 UMI 处理以及细胞×基因表达矩阵的生成；对于空间转录组数据，还包括图像配准、空间条形码和 UMI 处理以及 spot/bin×基因表达矩阵的生成。
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Bulk RNA-seq 数据分析——预处理及基因/转录本表达定量
首先，使用 Fastp v1.0.1（Chen 等，2018）通过预处理步骤过滤低质量 RNA-seq reads，并使用 RseQC v5.0.4（Wang 等，2012）推断 RNA-seq 文库的链特异性。随后，使用 STAR v2.7.11b（Dobin 等，2013）将高质量 RNA-seq reads 比对至相应物种的参考基因组。参考基因组序列及其匹配的基因注释来源于 Ensembl 或 NCBI Genome。完成序列比对后，使用 RSEM v1.2.28（Li 和 Dewey，2011）的默认参数进行基因/异构体组装与定量；在基础表达谱分析中，同时计算 RawCount、RPKM 和 TPM。
参考文献：
Chen S, Zhou
Y, Chen Y, et al. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ
preprocessor.
Bioinformatics.
2018,34(17):i884-i890.
PMID:30423086
Wang L, Wang
S, Li W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.
Bioinformatics.
2012,28(16):2184-2185.
PMID:22743226
Dobin A,
Davis CA, Schlesinger F, et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq
aligner.
Bioinformatics.
2013,29(1):15-21.
PMID:23104886
Li B, Dewey
CN. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with
or without a
reference
genome. BMC Bioinformatics. 2011,12:323.
PMID:21816040
Bulk RNA-seq 数据分析——RNA 编辑位点识别及 RNA 编辑水平定量
RNA 编辑位点的识别及 RNA 编辑水平定量主要由 REDItoolDenovo.py 完成，该脚本位于
REDItools 2.0（Picardi 等，2013）。首先，使用 REDItools 2.0 的并行策略，根据每个位点的 reads 覆盖度和变异频率识别并定量所有候选 RNA 编辑位点。其次，通过不同的参数配置分别筛选位于 Alu 区域和非 Alu 区域的候选 RNA 编辑位点，并结合基因注释、RepeatMasker、SNP 以及已知 RNA 编辑信息等多种注释文件进行后续注释。第三，由于非 Alu 区域中的编辑位点通常分布范围较窄，因此采用额外的筛选标准，以获得更准确的非 Alu 区域新型编辑位点。具体而言，使用 Pblat（Wang 和 Kong，2019）检测错配及多重比对 reads，并使用 Samtools（Li 等，2009）删除重复 reads。最后，将 RNA 编辑位点标记为新型位点或已知位点。当前版本同时包含 A-to-I 和 C-to-U 两种 RNA 编辑类型。
注释文件来源：(1) 基因注释文件：
GENCODE V33,
(2) RepeatMasker 注释文件：
UCSC,
(3) SNP 注释文件：
UCSC，(4) 已知 RNA 编辑位点：
REDIportal database.
使用以下工具将 RepeatMasker 文件和已知 RNA 编辑位点文件的基因组坐标从 hg19 转换为 hg38：
UCSC
liftover.
参考文献：
Picardi E,
Pesole G. REDItools: high-throughput RNA editing detection made easy. Bioinformatics. 2013,
29(14):1813-1814.
PMID:23742983
Wang M, Kong
L. pblat: a multithread blat algorithm speeding up aligning sequences to genomes. BMC
Bioinformatics. 2019, 20(1):28.
PMID:30646844
Li H,
Handsaker B, Wysoker A, et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.
Bioinformatics. 2009,25(16):2078-2079.
PMID:19505943
单细胞 RNA-seq 数据分析——序列比对及计数矩阵生成
对于来自 10X Genomics 平台的数据集，使用 CellRanger 生成数据。对于基于液滴的单细胞数据，矩阵计数步骤略为复杂，因为工具需要追踪每条 read 的来源（来自哪个细胞和哪个转录本；如使用 UMI，也需追踪 UMI）。获得每个基因的 read 计数矩阵是比对步骤的一部分，其中行通常对应基因，列对应细胞。
对于来自 Drop-seq 和 inDrop 的数据集，使用 dropEst 生成数据。
(1) dropTag：从文库中提取细胞条形码和 UMI。结果：拆分后的 .fastq.gz 文件，随后应比对到参考序列。
(2) 将拆分后的文件比对到参考基因组。结果：包含比对结果的 .bam 文件。
(3) dropEst：构建计数矩阵并估算质量控制所需的部分统计指标。结果：包含计数矩阵和统计信息的 .rds 文件；也可选择输出 MatrixMarket 格式的计数矩阵。
(4) dropReport：生成文库质量报告。
对于来自 Smart-seq2 和 SMARTer（Fluidigm C1）的数据集，其处理流程与 bulk RNA-seq 分析相同，包括 fastp、RSeQC 和 RSEM；不同之处在于 RSEM 步骤使用特殊参数“--single-cell-prior”，以 Dirichlet（0.1）作为先验来计算后验均值估计和可信区间。
空间转录组数据分析-图像对齐和空间计数矩阵生成
对于采用 10x Visium 和 10x Visium HD 技术生成的数据集，根据数据集和芯片类型的兼容性，使用 10x Genomics Space Ranger v4.0.1 或 v4.1.0 进行数据处理。处理流程包括组织图像配准、空间条形码和 UMI 的提取与校正、序列比对与基因归属、按 spot 或 bin 进行 UMI 计数，以及筛选组织区域下方的 spot 或 bin。对于 10x Visium HD 数据集，还会进一步进行多图像配准和 bin 聚合。最终输出包括 spot/bin×基因计数矩阵，以及包含组织图像和空间坐标的空间信息文件。
质量控制
针对不同测序策略，采用相应的标准化工作流程进行质量控制。对于 bulk RNA-seq 和 Smart-seq2 数据，使用 fastp 对测序读段进行修剪和过滤，碱基质量阈值为 Q20，每条读段中低质量碱基的比例不超过 20%，且读段最短长度为 40 bp。对于 10x Genomics 单细胞和 Visium 空间转录组数据，质量控制分别集成在 Cell Ranger 和 Space Ranger 流程中，除非另有说明，否则使用默认参数。对于 Drop-seq 和 inDrop 数据，使用 dropTag 和 dropEst 按照各自实验方案的特定配置进行处理，并使用 dropReport 生成质量报告。在适用情况下，将质量相关指标记录在 GEN 元数据中。
根据下方列出的结构化整理模型，对所有纳入的 RNA-seq 数据集元数据进行人工整理，分为“项目”“数据集”“数据谱”和“样本”4 个层级。
“项目”层级的整理模型
| 项目 |
说明 |
值（灰色文字：登录号前缀） |
| 数据资源 |
受控词表 |
NGDC、NCBI、EBI、DDBJ |
| BioProject ID |
数据资源中各 BioProject 的登录号 |
PRJCA, PRJNA,
PRJEB, or PRJDA
|
| 项目 ID |
数据资源中各系列或原始数据项目的登录号 |
CRA, GSE,
ERA, or DRP
|
| 项目名称 |
描述该项目的简要标题 |
归纳术语 |
| 物种 |
受控词表 |
智人、小鼠、黑腹果蝇等 |
| 测序策略 |
受控词表 |
Bulk RNA-seq、scRNA 10X Genomics、scRNA Smart-seq2 等 |
| 组织 |
受控词表 |
脑、肝、皮肤、肾、叶、根、种子等 |
| 细胞类型 |
受控词表 |
T 细胞、B 细胞等 |
| 细胞系 |
受控词表 |
CB660、H358、501 mel 等 |
| 健康情况 |
受控词表 |
哮喘、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、健康对照等 |
| 发育阶段 |
BioProject 中样本的发育阶段 |
归纳术语 |
| 样本数量 |
统计数据 |
项目中包含的样本数量 |
| 摘要 |
项目方案的简要说明 |
归纳术语 |
| 总体设计 |
实验设计，主要包括样本分组 |
归纳术语 |
| PMID |
描述该研究的出版物 |
PubMed ID 或 DOI |
| 发布日期 |
BioProject 在数据资源中的发布日期 |
包括年、月、日 |
| 提交日期 |
BioProject 在数据资源中的提交日期 |
包括年、月、日 |
| 更新日期 |
BioProject 在数据资源中的更新日期 |
包括年、月、日 |
“数据集”层级的整理模型
| 项目 |
说明 |
值（灰色文字：登录号前缀） |
| 数据集 ID |
GEN 中各数据集的登录号 |
GEND |
| BioProject ID |
数据资源中各 BioProject 的登录号 |
PRJCA, PRJNA,
PRJEB, or PRJDA |
| 项目 ID |
数据资源中各系列或原始数据项目的登录号 |
CRA, GSE,
ERA, or DRP
|
| 物种 |
受控词表 |
智人、小鼠、黑腹果蝇等 |
| 测序策略 |
受控词表 |
Bulk RNA-seq、scRNA 10X Genomics、scRNA Smart-seq2 等 |
| 基线 |
受控词表 |
是或否 |
| 遗传 |
受控词表 |
数据集中样本的遗传特征（突变、自然变异等）
|
| 表型 |
受控词表 |
数据集中样本的表型特征（疾病、性别、病毒感染等）
|
| 环境 |
受控词表 |
非生物胁迫、生物胁迫或生态暴露 |
| 空间 |
受控词表 |
细胞类型、细胞系、生物体、类器官和组织 |
| 时间 |
受控词表 |
发育、昼夜节律、时间序列 |
| RNA 类型 |
受控词表 |
去除 rRNA 的 RNA、poly(A)+ RNA、poly(A)- RNA 等 |
| 中位比对质量 |
统计数据 |
BioProject 中样本的中位比对率 |
| 中位覆盖度 |
统计数据 |
BioProject 中样本的中位覆盖度 |
| 最大测序长度 |
统计数据 |
BioProject 中样本的最大测序长度 |
| 最大重复数 |
统计数据 |
BioProject 中样本的最大重复数 |
| 组织 |
受控词表 |
脑、肝、皮肤、肾、叶、根、种子等 |
| 细胞类型 |
受控词表 |
T 细胞、B 细胞等 |
| 细胞系 |
受控词表 |
CB660、H358、501 mel 等 |
| 健康情况 |
受控词表 |
哮喘、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、健康对照等 |
| 发育阶段 |
BioProject 中样本的发育阶段 |
归纳术语 |
| 组别描述 |
病例/对照条件的详细说明 |
归纳术语 |
| 样本数量 |
统计数据 |
项目中包含的样本数量 |
| 数据集名称 |
数据集标题 |
归纳术语 |
“数据谱”层级的整理模型
| 项目 |
说明 |
值（灰色文字：登录号前缀） |
| GEN XProfile ID |
GEN 中基因表达谱的登录号 |
GENDX |
| GEN CProfile ID |
GEN 中 circRNA 表达谱的登录号 |
GENDC |
| GEN EProfile ID |
GEN 中基因编辑谱的登录号 |
GENDE |
| GEN SProfile ID |
GEN 中基因剪接谱的登录号 |
GENDS |
| 数据资源 |
受控词表 |
NGDC、NCBI、EBI、DDBJ |
| 项目 ID |
数据资源中各系列或原始数据项目的登录号 |
CRA, GSE,
ERA, or DRP |
| GEN 数据集 ID |
GEN 中各数据集的登录号 |
GEND |
| BioProject ID |
数据资源中各 BioProject 的登录号 |
PRJCA, PRJNA,
PRJEB, or PRJDA |
| 物种 |
受控词表 |
智人、小鼠、黑腹果蝇等 |
| 测序策略 |
受控词表 |
Bulk RNA-seq、scRNA 10X Genomics、scRNA Smart-seq2 等 |
| 参考基因组 |
参考基因组版本，例如 GRCh38 v99（如有需要，包含 ERCC） |
.fa、.fasta 或 .fna 文件 |
| 基因组注释 |
基因组注释版本，例如 GRCh38 v99（如有需要，包含 ERCC） |
.gff（或 .gff3、.gtf）文件和 .bed 文件 |
| 数据处理 |
针对不同测序策略执行质量控制、序列比对并生成表达矩阵
|
例如，对于 bulk/scRNA Smart-seq2，使用 Fastp v0.20.0 进行质量控制，使用 RseQC v2.6.4 推断链特异性，并分别使用 STAR v2.7 和 RSEM v1.3.1 进行序列比对和生成表达谱
|
“样本”层级的整理模型
| 项目 |
说明 |
值（灰色文字：登录号前缀） |
| 基本信息 |
| 数据资源 |
受控词表 |
NGDC、NCBI、EBI、DDBJ |
| 项目 ID |
数据资源中各系列或原始数据项目的登录号 |
CRA, GSE,
ERA, or DRP |
| BioProject ID |
数据资源中各 BioProject 的登录号 |
PRJCA, PRJNA,
PRJEB, or PRJDA |
| BioSample ID |
数据资源中各 BioSample 的登录号 |
SAMC, SAMN, or
SAME
|
| 样本名称 |
数据资源中各样本的名称 |
归纳术语 |
| 样本登录号 |
数据资源中各原始数据样本的登录号 |
CRS, SRS, or
ERS
|
| 实验登录号 |
数据资源中各实验样本的登录号 |
CRX, SRX, or
ERX
|
| GEN 数据集 ID |
GEN 中各数据集的登录号 |
GEND |
| GEN 样本 ID |
GEN 中各样本的登录号 |
GENDS |
| 发布日期 |
样本数据在数据资源中的发布日期 |
包括年、月、日 |
| 提交日期 |
样本数据在数据资源中的提交日期 |
包括年、月、日 |
| 更新日期 |
样本数据在数据资源中的更新日期 |
包括年、月、日 |
| 样本特征 |
| 物种 |
受控词表 |
智人、小鼠、黑腹果蝇等 |
| 种族/品种/品系 |
归纳术语 |
种族是指人的身体特征，例如骨骼结构以及皮肤、头发或眼睛颜色。例如美洲印第安人、亚洲人、黑人、西班牙裔、白人等。
品种是指具有相对一致的外观（表型）、行为和/或其他特征，且可与同一物种其他个体区分的一类特定家养动物群体。
品系是指植物、病毒或细菌的变体，或用于实验目的的近交动物。
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| 族群/国家 |
受控词表 |
族群是指文化因素，包括国籍、地域文化、祖先来源和语言。例如德国或西班牙血统，或汉族。
|
| 年龄 |
统计数据 |
样本（患者、健康供体等）的年龄 |
| 年龄单位 |
受控词表 |
样本的年龄单位（年、周、日等） |
| 性别 |
受控词表 |
男性、女性等 |
| 来源名称 |
各样本组的名称 |
归纳术语 |
| 组织 |
受控词表 |
脑、肝、皮肤、肾、叶、根、种子等 |
| 细胞类型 |
受控词表 |
T 细胞、B 细胞等 |
| 细胞亚型 |
受控词表 |
细胞亚型或细胞群 |
| 细胞系 |
受控词表 |
CB660、H358、501 mel 等 |
| 生物学条件 |
| 健康情况 |
受控词表 |
哮喘、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、健康对照等 |
| 疾病状态 |
样本的疾病阶段 |
归纳术语 |
| 发育阶段 |
样本的发育阶段 |
归纳术语 |
| 突变 |
相关基因突变 |
归纳术语 |
| 表型 |
样本的表型特征 |
归纳术语 |
| 实验变量 |
| 对照详情 |
样本不同分组情况的组别简要描述 |
归纳术语 |
| 实验方案 |
| 生长方案 |
样本来源细胞或细胞系的培养方案 |
归纳术语 |
| 处理方案 |
样本处理方案 |
归纳术语 |
| 提取方案 |
RNA 提取方案 |
归纳术语 |
| 文库构建方案 |
RNA 测序文库构建方案 |
归纳术语 |
| 分子类型 |
受控词表 |
去除 rRNA 的 RNA、poly(A)+ RNA、poly(A)- RNA 等 |
| 文库布局 |
受控词表 |
双端、单端 |
| 链特异性 |
受控词表 |
特异、非特异 |
| 文库链方向 |
受控词表 |
Reverse 表示第一链，Forward 表示第二链，短横线（-）表示非链特异性
|
| 外源加标 |
受控词表 |
ERCC 或 - |
| 测序技术 |
| 测序策略 |
受控词表 |
Bulk RNA-seq、scRNA 10X Genomics、scRNA Smart-seq2 等 |
| 平台 |
受控词表 |
Illumina、BGISEQ 等 |
| 仪器型号 |
受控词表 |
Illumina HiSeq 2000、Illumina NextSeq 500、BGISEQ-500 等
|
| 质量评估 |
| 细胞数 |
统计数据 |
估算的细胞数量 |
| Reads 数 |
统计数据 |
fastq 文件中的 reads 数量 |
| Bases |
统计数据 |
过滤后的总碱基数 |
| AvgSpotLen1 |
统计数据 |
Spot1 的平均长度（如经过过滤，则为过滤后的长度） |
| AvgSpotLen2 |
统计数据 |
Spot2 的平均长度（如经过过滤，则为过滤后的长度） |
| 唯一比对率 |
计算数据 |
唯一比对 reads 的百分比 |
| 多重比对率 |
计算数据 |
多重比对 reads 的百分比 |
| 覆盖率 |
计算数据 |
总比对 reads 数量 × 平均 read 长度 / 参考基因组总碱基数 |
基因功能注释
为了更好地理解多物种中的基因功能，GEN 为用户提供每个基因的多维信息作为参考。基因基本信息（包括 Entrez ID、RefSeq ID、Symbol、Position 等）来源于基因组注释谱。此外，基因摘要中还展示管家基因或组织特异性基因、基因本体、疾病本体，以及 Genome Browser 中的基因结构可视化信息。每个基因还会链接来自
GeneCard,
EDK
和
ICG 的外部信息（如可用）。
组织特异性（TS）基因和管家（HK）基因的定义
管家基因和组织特异性基因根据以下来源的表达谱进行定义：
GTEx portal （基因型-组织表达项目，覆盖 53 种正常人体组织）。首先过滤掉在所有组织中最高表达值低于 0.5 TPM/FPKM 的基因。随后使用组织特异性指数 τ 值和 CV（变异系数）值判定管家基因（HK，τ 值 <= 0.5 且 CV <= 0.5）和组织特异性基因（TS，τ 值 >= 0.95）。
τ 指数定义如下：
 |
其中，N 为组织数量，表达谱分量由最大分量值归一化。CV 是 coefficient of variation（变异系数）的缩写，表示基因表达水平在不同组织之间的波动程度。变异系数（CV）定义为不同组织中基因表达水平的标准差与均值之比。
参考文献：
Yanai I, Benjamin H, Shmoish M, et al. Genome-wide midrange
transcription profiles reveal expression level relationships in human tissue specification.
Bioinformatics. 2005,21(5):650-659.
PMID:15388519
来源于 GTEx 和 REDIportal 的基因表达谱与 RNA 编辑谱参考数据
正常人体组织或身体部位的参考基因表达水平和 RNA 编辑水平分别获取自
GTEx portal 和and
REDIportal。为概览整体表达和 RNA 编辑模式，“基因摘要”部分展示每个基因在 53 种组织中的“平均值”“中位数”“最大值”“最小值”表达水平及 RNA 编辑水平，以及“CV”“τ 值”和“表达广度”；这些指标也可作为基因筛选条件。
数据集筛选与差异表达基因分析
疾病相关注释基于经过人工整理、具有明确疾病组和对照组元数据的人类整体RNA测序（bulk RNA-seq）数据集生成。仅当至少有3个疾病样本和3个正常对照样本时，才纳入疾病组与对照组的比较。正常对照是指源数据元数据中标注为healthy、normal、control、healthy control、normal control或其他等效非疾病对照的样本。每项比较均在其原始数据集内使用DESeq2（v1.50.2）独立分析，不跨研究合并表达矩阵。
差异表达基因（DEGs）的定义标准为：经Benjamini–Hochberg方法校正后的P值 < 0.05，且|log2(fold change)| ≥ 1。表达变化方向以相应对照组为参照：log2(fold change)为正表示基因在疾病样本中上调，为负则表示下调。
跨数据集整合
对于涉及多个数据集的疾病，仅保留至少两个独立数据集共同支持的差异表达基因，用于疾病层面的整合。当具有表达方向证据的数据集中至少70%显示相同的变化方向时，才为该基因指定疾病层面的表达变化方向。否则，不赋予明确的上调或下调方向，并将该基因视为方向不一致。
功能与药物注释
使用clusterProfiler（v4.18.4），分别对全部、上调和下调差异表达基因在生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）三个GO类别中进行富集分析。经Benjamini–Hochberg方法校正后的P值 < 0.05的条目被认为具有统计学显著性。对于包含多个数据集的疾病，全部差异表达基因集合中的基因须至少在两个数据集中重复出现，而按表达方向划分的差异表达基因集合还须满足上述方向一致性规则。
将DGIdb（2024年6月）的药物-基因相互作用信息与疾病相关差异表达基因进行整合。根据疾病层面的表达方向和已注释的药物作用，将药物-基因关系分为逆向、同向、冲突或未知。进一步将疾病-药物配对划分为候选类别，包括强逆向、弱逆向、混合逆向、冲突、方向未知和不予优先考虑。
 |
对于包含一个对照组和一个病例组的选定项目，病例组将直接与对照组进行比较。
Limma （Law 等，2014）是一个最初为微阵列数据差异表达（DE）分析开发的 R 包。voom（Ritchie 等，2015）是 limma 包中的一个函数，可将 RNA-Seq 数据转换为适用于 limma 的形式。Limma-voom 结合使用，可对 RNA-Seq 数据进行快速、灵活且强大的差异表达分析。
limma 的 RNA-seq 分析流程以基因层面的计数作为输入，依次进行预处理和探索性数据分析，最终获得差异表达基因列表和基因特征。在 limma 中，对假定服从正态分布的 log-CPM 值进行线性建模，并使用 voom 函数计算的精度权重处理均值-方差关系。随后，limma 使用 lmFit 和 contrasts.fit 函数分别为每个基因的表达值拟合模型。接着，通过在所有基因间借用信息进行经验贝叶斯校正，从而获得更精确的基因层面变异估计。最后，可使用 topTable 列出基于 eBayes 结果得到的显著差异表达基因。
参考文献：
Ritchie ME, Phipson B, Wu D, et al. limma powers
differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids
Res. 2015,43(7):e47.
PMID:25605792
Law CW, Chen Y, Shi W, et al. voom: Precision weights
unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts. Genome Biol. 2014,15(2):R29.
PMID:24485249
加权基因共表达网络分析（WGCNA）是一种广泛使用的数据挖掘方法，由 Steve Horvath 开发（Zhang 和 Horvath，2005；Langfelder 和 Horvath，2008）。
WGCNA package 包括网络构建、模块检测、基因选择、拓扑属性计算、可视化以及与外部软件交互等功能。WGCNA 可用于寻找高度相关基因的聚类（模块），使用模块特征基因或模块内枢纽基因概括这些聚类，分析模块之间以及模块与外部样本性状之间的关系（采用特征基因网络方法），并计算模块成员度。相关网络有助于开展基于网络的基因筛选，从而识别候选生物标志物或治疗靶点。
参考文献：
Zhang B, Horvath S. A general framework for weighted
gene co-expression network analysis. Stat Appl Genet Mol Biol. 2005,4:Article17.
PMID:16646834
Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for
weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008,9:559.
PMID:19114008
在此，我们采用
clusterProfiler
package，这是由 Yu Guangchuang 开发的通用富集分析工具，可用于功能和比较研究（Yu 等，2012）。
clusterProfiler 包提供一种基因分类方法，可根据基因在 GO 语料体系特定层级上的投影进行分类，并提供 enrichGO、enrichKEGG 和 enrichDO 函数，基于超几何分布分别计算 GO 术语、KEGG 通路和 DO 术语的富集检验。为避免多重检验中较高的错误发现率（FDR），还会估算 q 值以控制 FDR。此外，clusterProfiler 提供用于展示分析结果的可视化模块。
1. 基因本体（GO）
基因本体定义了用于描述基因功能的概念/类别及这些概念之间的关系，并从以下三个方面对功能进行分类：
MF：分子功能（基因产物的分子活动）
CC：细胞组分（基因产物发挥作用的位置）
BP：生物过程（由多个基因产物活动组成的通路和更大尺度的过程）
GO 术语以有向无环图组织，术语之间的边表示父子关系。
2. 京都基因与基因组百科全书（KEGG）
KEGG 是一组人工绘制的通路图，用于表示分子相互作用和反应网络。这些通路涵盖广泛的生化过程，可分为 7 大类：代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、个体系统、人类疾病和药物开发。
3. 疾病本体（DO）
疾病本体是一种标准化的人类疾病本体，旨在为生物医学界提供一致、可复用且可持续的人类疾病术语、表型特征及相关医学词汇疾病概念描述。
参考文献：
Yu G, Wang LG, Han Y, et al. clusterProfiler: an R
package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012,16(5):284-287.
PMID:22455463
在此，我们采用
GENIE3
package （Huynh-Thu 等，2010），利用回归树集成方法从表达数据中推断基因调控网络（以加权邻接矩阵形式表示）。来自
TRRUST
package （Han 等，2018）的已知调控因子将被筛选，用于预测其靶基因。完成调控网络预测后，我们还会根据 TRRUST 的人工整理结果，对已知调控因子-靶基因相互作用进行进一步注释。
参考文献：
Huynh-Thu VA, Irrthum A, Wehenkel L, et al. Inferring
regulatory networks from expression data using tree-based methods. PLoS One.
2010,5(9):e12776.
PMID:20927193
Han H, Cho JW, Lee S, et al. TRRUST v2: an expanded
reference database of human and mouse transcriptional regulatory interactions. Nucleic Acids
Res. 2018,46(D1):D380-D386.
PMID:29087512
本工具旨在分析单细胞 RNA-seq 数据，并推断每个细胞簇的细胞类型。Seurat 聚类流程的主要组成部分基于
Seurat
3.12 package实现，包括质量控制和数据过滤、高变基因计算、降维、基于图的聚类以及细胞簇标记基因识别（Stuart 等，2019）。此外，我们还基于
SingleR package （Aran 等，2019）提供的纯细胞类型参考转录组数据集，对每个细胞簇进行无偏细胞类型识别。
当前版本支持来自单个样本或单个项目的 SMARTer（Fluidigm C1）、Smart-seq2 或 10X Genomics 单细胞 RNA-seq 数据。由于跨不同条件和技术生成的单细胞数据集整合分析耗时较长，目前暂不支持。用户可下载数据并在本地计算机上进行分析。
步骤 1
数据输入（包括表达谱和元信息）。根据质量控制指标选择并过滤细胞。
步骤 2
数据归一化和缩放。默认采用全局缩放归一化方法“LogNormalize”：以每个细胞的总表达量对该细胞的基因表达测量值进行归一化，再乘以缩放因子（默认为 10,000），最后进行对数转换。也可根据不同需求选择其他方法。
步骤 3
计算高变基因，用于后续下游分析。FindVariableGenes 会计算每个基因的平均表达量和离散度，将基因分箱，然后计算各箱内离散度的 z-score，从而有助于控制变异性与平均表达量之间的关系。
步骤 4
根据 PCA 得分确定数据集的维度。每个 PC 本质上代表一个“元特征”，整合了一组相关特征的信息。ElbowPlot 可用于判断前多少个 PC 已捕获大部分真实信号。
步骤 5
聚类树展示随着分辨率提高，细胞簇如何分裂、哪些簇彼此清晰独立、哪些簇相互关联，以及随着簇数量增加样本如何改变分组。根据聚类树结果推断的分辨率进行聚类，执行非线性降维（UMAP/tSNE），并识别差异表达特征（细胞簇生物标志物）。降维技术可将单细胞 RNA-seq 计数矩阵原本极高维度的数据（例如约 30,000 个基因 × 10,000 个细胞）表示为二维 xy 坐标。每个基因的表达水平均可在 tSNE 或 UMAP 图中可视化。
步骤 6
查找所有细胞簇的标记基因，并进行基因集富集分析。
步骤 7
轨迹推断功能由 Monocle 提供。该工具先通过差异表达检验减少基因数量，再使用独立成分分析进一步降维。构建轨迹时，Monocle 会计算最小生成树，然后找到该树中最长的连通路径。
步骤 8
细胞类型注释通常是分析 scRNA-seq 数据集的主要目标。GEN 配备 SingleR，根据某些基因仅在特定细胞簇中表达（标记基因）的规则为细胞分配标签，从而推断“细胞类型”。内置参考转录组数据集包括 5 个人类数据集和 2 个小鼠数据集，具体如下：
(1) Human Primary Cell Atlas（Mabbott 等，2013）：基于 713 个微阵列数据样本，包含 37 种主要非特异性细胞类型和 157 种精细细胞类型；Consortium 2012 数据集：基于 259 个 RNA-seq 样本，包含 24 种主要非特异性细胞类型和 43 种精细细胞类型。
(2) Blueprint（Martens 和 Stunnenberg，2013）与 ENCODE（The ENCODE Project Consortium，2012）数据集：基于 259 个 RNA-seq 样本，包含 24 种主要非特异性细胞类型和 43 种精细细胞类型。
(3) Monaco Immune Dataset（Monaco 等，2019）：基于 114 个 RNA-seq 样本，包含 11 种主要免疫细胞类型和 29 种精细细胞类型。
(4) Novershtern Hematopoietic Dataset（Novershtern 等，2011；Monaco 等，2019）：基于 211 个微阵列数据样本，包含 17 种主要免疫细胞类型和 38 种精细细胞类型。
(5) Database Immune Cell Expression Dataset（Schmiedel 等，2018）：基于 1,561 个 RNA-seq 样本，包含 5 种主要造血和免疫细胞类型及 15 种精细细胞类型。
(6) Immunological Genome Project（ImmGen）（Heng 等，2008）：基于 830 个微阵列数据样本，包含 20 种主要造血和免疫细胞类型及 253 种精细细胞类型。
(7) Mouse RNA-seq Dataset（Benayoun 等，2019）：基于 358 个 RNA-seq 样本，包含 18 种非特异性细胞类型和 28 种精细细胞类型。
参考文献：
Stuart T, Butler A, Hoffman P, et al. Comprehensive
Integration of Single-Cell Data. Cell. 2019, 177(7):1888-1902. e21.
PMID:31178118
Aran D, Looney AP, Liu L, et al. Reference-based
analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage.
Nat Immunol. 2019,20(2):163-172.
PMID:30643263
Mabbott N A, Baillie J K, Brown H, et al. An expression atlas of human
primary cells: inference of gene function from coexpression networks.
BMC genomics. 2013, 14(1): 1-13.
PMID:24053356
Martens J H A, Stunnenberg H G. BLUEPRINT: mapping human blood cell
epigenomes.
Haematologica. 2013, 98(10): 1487.
PMID:24091925
Monaco G, Lee B, Xu W, et al. RNA-Seq signatures normalized by mRNA abundance
allow absolute deconvolution of human immune cell types.
Cell reports, 2019, 26(6): 1627-1640. e7.
PMID:30726743
Novershtern N, Subramanian A, Lawton L N, et al. Densely interconnected
transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.
Cell, 2011, 144(2): 296-309.
PMID:21241896
Schmiedel B J, Singh D, Madrigal A, et al. Impact of genetic polymorphisms on
human immune cell gene expression.
Cell, 2018, 175(6): 1701-1715. e16.
PMID:30449622
Heng T S P, Painter M W, Elpek K, et al. The Immunological Genome Project:
networks of gene expression in immune cells.
Nature immunology, 2008, 9(10): 1091-1094.
PMID:18800157
Benayoun B A, Pollina E A, Singh P P, et al. Remodeling of epigenome and
transcriptome landscapes with aging in mice reveals widespread induction of inflammatory
responses.
Genome research, 2019, 29(4): 697-709.
PMID:30858345
GEN数据库建立了统一的数据提交标准，对提交文件的分类、格式及样本元数据注释进行规范化管理。相关标准通过预定义选项、必填字段要求和文件准备指南整合至数据提交流程中，以确保提交数据的规范性、一致性和可用性。具体的受控词表及基于本体的标准化注释要求如下。
1. 文件信息
文件信息部分对提交文件的类型和数据格式进行标准化管理，包括计数矩阵、元数据和图像等。
| 项目 |
说明 |
取值（预定义选项） |
| 文件类型 |
提交文件的类别。 |
计数矩阵（Count matrix）、元数据（Metadata）、图像（Image）、空间坐标（Spatial coordinates）等 |
| 文件格式 |
提交文件的数据格式。 |
MEX bundle; H5 (10x/CellRanger); H5AD (AnnData); Loom; RDS; Zarr; TileDB-SOMA; TSV; CSV; TXT; Parquet; NPZ/NPY; H5Seurat; MuData (H5MU); JSON; XLSX; BED; GTF/GFF; BigWig; |
样本元数据字段根据实际情况采用受控词表或基于本体的标准注释，以确保不同提交数据集中生物学信息与实验描述的一致性。
| 项目 |
说明 |
标准化方式 |
| 物种 |
样本来源的物种。 |
NCBI 本体（NCBI Ontology） |
| 组织 |
样本来源的组织或解剖部位。 |
BRENDA 组织本体（BRENDA Tissue Ontology） |
| 疾病 |
与样本相关的疾病或病理状态。 |
疾病本体（Disease Ontology） |
| 文库策略 |
用于生成测序文库的实验策略。 |
Spatial NanoString GeoMx; Spatial Curio Seeker; Spatial DBiT-seq; Spatial STARmap; Spatial Pixel-Seq; Spatial Resolve (Bruker); Spatial HDST; scMultiome (RNA+ATAC, 10x); CITE-Seq; REAP-Seq; SHARE-Seq; SNARE-Seq; Patch-Seq; Perturb-Seq (CRISPR); scTCR-Seq; scBCR-Seq; Microarray Affymetrix GeneChip; Microarray Illumina BeadArray; Microarray Agilent; Microarray NimbleGen; Microarray CodeLink; Microarray cDNA (two-color); OTHER |
| 文库布局 |
测序文库的读段布局。 |
单端（Single）、双端（Paired） |
| 测序平台 |
生成数据所使用的测序平台。 |
ABI_SOLID; BGISEQ; CAPILLARY; COMPLETE_GENOMICS; DNBSEQ; ELEMENT; GENAPSYS; GENEMIND; GENEUS_TECH; HELICOS; ILLUMINA; ION_TORRENT; LS454; OXFORD_NANOPORE; PACBIO_SMRT; SALUS |
| 仪器型号 |
生成数据所使用的具体仪器型号。 |
Illumina NovaSeq 6000; Illumina NovaSeq X; Illumina NovaSeq X Plus; Illumina HiSeq 4000; Illumina HiSeq 3000; Illumina HiSeq 2500; Illumina HiSeq 2000; Illumina HiSeq 1500; Illumina HiSeq 1000; Illumina HiSeq X; HiSeq X Ten; HiSeq X Five; NextSeq 2000; NextSeq 1000; NextSeq 550; NextSeq 500; Illumina MiSeq; Illumina MiniSeq; Illumina iSeq 100; MiSeq i100; MiSeq i100 Plus; Illumina HiScanSQ; Illumina Genome Analyzer; Illumina Genome Analyzer II; Illumina Genome Analyzer IIx; Xenium Analyzer; G4X; BGISEQ-500; BGISEQ-50; MGISEQ-2000RS; CycloneSEQ; DNBSEQ-T7; DNBSEQ-T1+; DNBSEQ-G400; DNBSEQ-G400 FAST; DNBSEQ-G50; PromethION; GridION; MinION; Sequel IIe; Sequel II; Sequel; Revio; Onso; PacBio RS II; PacBio RS; Ion Torrent Genexus; Ion GeneStudio S5 Prime; Ion GeneStudio S5 Plus; Ion GeneStudio S5; Ion Torrent S5 XL; Ion Torrent S5; Ion Torrent Proton; Ion Torrent PGM; 454 GS FLX+; 454 GS FLX Titanium; 454 GS FLX; 454 GS 20; 454 GS; 454 GS Junior; ELEMENT-AVITI; G4; UG 100; Sentosa SQ301 |
提交者须在受控词表字段中选择预定义取值，并在物种和组织注释中使用受支持的本体术语。所有必填元数据字段均须按照提交模板及字段规范完整填写。
3. 文件准备与校验
提交文件必须符合提交流程中规定的受支持文件格式及结构要求。提交者应确保所需文件齐全、文件可正常读取且格式正确，并保证文件记录与相关元数据保持一致。提交过程中会执行必填字段检查以及适用的文件检查，以识别需要在完成提交前解决的信息缺失或文件格式问题。
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